2.1.2 - LA CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION :

Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage moléculaire, gel-filtration ou perméation de gel.

Principe :

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On utilise pour cela des granules de gel poreux. Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort ( Vm ou V0 ). Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée. Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires. Il existe une relation linéaire entre le volume d'élution et le logarithme de la masse moléculaire.

Figure 1 : Schéma du tamisage moléculaire.

Types de gels :

• Gels hydratés (les plus utilisés) : le Séphadex^TM (G10 à G200) qui sont des polyosides bactériens de type dextran (poly D-glucopyranosyl a, 1 -> 6), et le Sépharose^TM (agarose).
  
  Le gain d'eau correspond au nombre de grammes d'eau fixés par gramme de substance sêche.
• Gels permanents : ce sont des copolymères organiques ou bien des minéraux (silice). Ici, des effets d'adsorption s'ajoutent au tamisage moléculaire.

Figure 2 : Représentation d'un gel d'exclusion.

Représentation des résultats :

• Soit l'on porte logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution (Figure 2 ci-dessous) : log MM = f (V_e)
• Soit l'on porte logarithme de la masse moléculaire en fonction du KAV, le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (K_AV).

Le K_AV, est le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel :

KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm)

• V_t = volume total (il est mesuré en remplissant la colonne d'eau)
• V_m = volume mort (il est déterminé en mesurant le V_e d'une substance totalement exclue)

Représentation du logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution :


Figure 3 : Variation du volume d'élution en fonction de log MM.

Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc éluées les premières, au niveau du volume mort ( V_m ou V₀ ).

Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses dans le gel, leur migration est freinée.

Une molécule totalement incluse sera éluée avec un volume d'élution V* = V_m + V_i, où V_i est le volume d'eau interne aux granules de gel(voir plus bas).

Les solutés sont donc élués dans l'ordre inverse des masses moléculaires (voir figure ci-dessous).


Figure 4 : Elution des solutés dans l'ordre inverse des masses moléculaires.

Théorie de la chromatographie d'exclusion :

On considère une colonne de volume total V_total remplie d'un gel solvaté :

Vtotal = V0 + Vi + Vg

• V₀ = V_m = volume d'eau externe aux granules
• V_i = volume d'eau interne aux granules
• V_g = volume du gel

Un soluté est distribué dans l'eau interne et l'eau externe selon un coefficient de distribution (de partage) : K

• si K = 0,le soluté est totalement exclu.
• si 0 < K <1, le soluté est partiellement inclus. Le taux d'inclusion augmente avec K.
• si K = 1, valeur théorique correspondant à une inclusion totale d'un composé dans le gel.
• si K > 1, le soluté est inclus et adsorbé.

Figure 5 : Diagramme d'élution des substances A et B.

Donc, si l'on dépose un mélange de 2 solutés A et B dont les constantes de distribution sont respectivement égales à 0 et 1,

• A sera élué avec un volume d'élution V_e^A = V_m
• B sera élué avec un volume d'élution V_e^B = V_m + V_i

L'expression générale qui relie le volume d'élution d'un soluté à son coefficient de distribution est :


La constante K est égale à : concentration du soluté dans l'eau interne / concentration du soluté dans l'eau externe.