2.1.6 - LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITÉ : Principe : Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique pour un soluté de l'échantillon à analyser. Trois types d'affinités sont utilisées : affinité enzyme-substrat affinité ligand-récepteur affinité antigène-anticorps Très souvent, la molécule fixée sera le substrat, le ligand, ou bien l'anticorps. Ceci permettra de purifier l'enzyme, le récepteur ou l'antigène, respectivement. Figure 1 : Les trois étapes d'une chromatographie d'affinité. 1 - Etape de FIXATION : Le mélange de molécules contenant le composé à purifié est chargé sur la colonne d'affinité. Seule la molécule présentant une affinité pour la colonne sera retenue par l'effecteur greffé sur la phase stationnaire. 2 - Etape de PURIFICATION : En continuant à faire passer du tampon dans la colonne, toutes les molécules contaminantes sont éliminées et éluées. 3 - Etape d'ELUTION : La molécule purifiée est déccrochée de la colonne et est recueillie dans l'éluat. Souvent, l'un des deux partenaires de l'interaction au moins est une protéine (P), l'autre sera qualifié de ligand (L) de cette protéine : P + L <=> PL L'association de P et de L forme le complexe PL. La constante définissant cet équilibre est : Ka = (P).(L) / (PL) NB : C'est une constante d'association à l'équilibre, qui s'écrit donc avec un "K" majuscule. La phase stationnaire (le gel d'affinité) : elle est constituée d'un effecteur fixé par covalence à un support (carboxyméthylcellulose, Séphadex, gel de polyacrylamide) par l'intermédiaire d'un bras de fixation ("spacer" en anglais). Exemples de dérivés de la carboxyméthylcellulose ou CM-cellulose : La CM-aminohexylique : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle. - O - CH2 - CO - NH - (CH2)6 - NH2 (spacer long) La CM-hydrazide : permet la fixation d'un effecteur à fonction carboxyle. - O - CH2 - CO - NH - NH2 (spacer court) La CM- aminohexylique (ou aminododécylique) succinylée : permet la fixation d'un effecteur à fonction -NH2 réactive. - O - CH2 - CO - NH - (CH2)n -NH - CO - CH2 - CH2 - COOH (n = 6 ou 12, spacer long) La longueur du bras est choisie de manière à limiter les contraintes stériques. Effecteurs : Affinité enzyme-substrat : substrats, analogues, inhibiteurs réversibles, effecteurs allostériques, coenzymes. Affinité ligand-récepteur : haptènes, antigènes, anticorps. Affinité antigène-anticorps : hormones, peptides, analogues peptidiques. Elution : elle peut être réalisée de différentes façons : Tampon de pH différent de celui ayant permis la charge : changement de l'état d'ionisation d la protéine : désorption Tampon de force ionique différente de celle ayant permis la charge : changement de conformation de la protéine. Compétition avec un ligand libre.